核酸檢測(cè)的一場(chǎng)革命，可替代PCR的犀利技術(shù)

發(fā)布: 2014-10-31 12:58    作者: webmaster    來(lái)源: 生物通 

自PCR技術(shù)誕生以來(lái)已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。

英國(guó)TwistDx Inc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA技術(shù)犀利在何處

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的最適溫度在37°C - 42°C之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。

據(jù)介紹，RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)。

RPA既可以擴(kuò)增DNA也可以擴(kuò)增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，還可以對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。

目前，TwistAmp? 試劑盒的擴(kuò)增子長(zhǎng)度在500bp以內(nèi)。不過，經(jīng)過特別優(yōu)化的RPA擴(kuò)增，也可以生成更長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，或者減慢擴(kuò)增速度（便于定量），甚至在更低的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。

RPA技術(shù)的基本原理

RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。

ViaFect轉(zhuǎn)染試劑

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。

RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系（TwistAmp? Basic）含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴(kuò)增結(jié)果可以通過凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個(gè)基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來(lái)說，TwistAmp? Basic RT添加了逆轉(zhuǎn)錄酶，可以對(duì)RNA模板進(jìn)行一步法擴(kuò)增。

TwistAmp? exo結(jié)合了專利的exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點(diǎn)的擴(kuò)增子總量有所減少，適合獲得強(qiáng)熒光信號(hào)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(cè)（比如跑膠）。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來(lái)的TwistAmp? exo RT，可以一步實(shí)現(xiàn)RNA模板的實(shí)時(shí)擴(kuò)增。

TwistAmp? fpg是一個(gè)添加了核酶fpg的實(shí)時(shí)報(bào)告體系。fpg探針技術(shù)的熒光累積比較慢，但終點(diǎn)的擴(kuò)增子產(chǎn)量不會(huì)減少，因此也能支持終點(diǎn)分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，比如測(cè)流層析試紙條LFD。

除此之外，RPA擴(kuò)增還可以很簡(jiǎn)單的實(shí)現(xiàn)多重化。只需要增加引物/探針就可以一次性檢測(cè)多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。PCR引物多半是不適用的，因?yàn)镽PA引物比一般PCR引物長(zhǎng)，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基。引物過短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度。

在設(shè)計(jì)RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴(kuò)增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計(jì)不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。雖然還沒有設(shè)計(jì)軟件可以使用，不過TwistDx Inc公司在自己的網(wǎng)站上提供了相應(yīng)的篩選指南。

需要注意的是，目前的TwistAmp? 擴(kuò)增試劑盒都沒提供RNase抑制劑。另外，受目前的生產(chǎn)方法所限，RPA反應(yīng)不適合用于E. coli標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室菌株的擴(kuò)增。(生物谷Bioon.com)